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產(chǎn)品分類原位雜交實驗的實驗流程和樣本處理注意事項
上海信帆提供原位雜交實驗檢測服務(wù)。原位雜交實驗通常流程由組織切片+探針+DAB染色+掃片或者拍照構(gòu)成,那么詳細(xì)的操作步驟和對樣本的處理要求具體是什么呢,讓我們一起來探索一下吧!
實驗流程:
1、組織固定:組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。
2、脫水:組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟,包埋。
3、切片:石蠟經(jīng)切片機切片,攤片機撈片,62°烤箱烤片2h。
4、石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。
5、消化:根據(jù)組織固定時間長短,切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘,自然冷卻。后基因筆畫圈,根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性,滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30 min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。
6、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶:滴加3%甲醇-H2O2,室溫避光孵育15min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
7、預(yù)雜交:滴加預(yù)雜交液,37°C孵育1h。
8、雜交:傾去預(yù)雜交液,滴加含探針雜交液, 恒溫箱 37度雜交過夜。
9、雜交后洗滌:洗去雜交液,2×SSC,37°C 洗10min,1×SSC,37°C洗2×5min,0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多,可以增加甲酰胺洗滌。
10、滴加封閉液:滴加封閉血清 BSA。室溫30min。
11、滴加鼠抗高辛標(biāo)記過氧化物酶(anti-DIG-HRP):傾去封閉液,滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育40min,后PBS洗4次×5min。
12、DAB顯色:切片稍甩干后,在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液,顯微鏡下控制顯色時間,陽性為棕黃色,純水沖洗切片終止顯色。
13、復(fù)染細(xì)胞核:Harris蘇木素復(fù)染3min左右,自來水洗,1%鹽酸酒精分化數(shù)秒,自來水洗,氨水返藍(lán),流水沖洗。
14、脫水封片:將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I(xiàn) 6min—100%酒精I(xiàn)I 6min-正丁醇6min—二甲苯透明,將切片從二甲苯中拿出稍晾干后,中性樹膠封片。
15、顯微鏡檢,圖像采集分析。
結(jié)果判讀:
陽性為棕黃色,細(xì)胞核為藍(lán)色。
送樣要求:
1、切片前處理要求:新鮮組織干冰運輸后做冰凍切片;或取2mm左右厚度的新鮮組織,5min內(nèi)投入原位雜交固定液內(nèi)固定,4℃低溫保存運輸,切勿冷凍結(jié)冰,盡快包埋切片后進行原位雜交實驗,固定時間過長影響核酸檢出率;
2、冰凍切片:冰凍切片-20℃運輸;
3、石蠟切片:石蠟切片常溫運輸;
4、細(xì)胞爬片:細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15min后,換無酶PBS,密封,4℃運輸。
原位雜交實驗的實驗流程和樣本處理注意事項
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